1999. Revista Chapingo Serie Horticultura 5: 231-237.

 

 

CULTIVO in vitro DEL AGUACATERO (Persea americana Mill.)

 

 

N. N. Rodríguez; M. Capote; V. Zamora

Instituto de Investigaciones de Cítricos y otros Frutales, Cuba.

 

 

RESUMEN

Se cultivaron embriones inmaduros y maduros de diferentes cultivares de aguacatero (Persea americana Mill.) en el medio mineral de Murashige y Skoog (1962) a la mitad de su concentración, con la adición de 0.5 mg·litro^-1 de BA (6-bencil aminopurina) en un caso y de 0.5 mg·litro^-1 de BA y de GA₃ (ácido giberélico) en el otro. Los mejores resultados se obtuvieron en el medio que contenía GA₃  donde se logró la formación de 3 a 10 brotes por embrión.  El subcultivo en el mismo medio basal con 2.0 mg·litro^-1 de AIB (ácido indol-3-butírico) y 0.5% (p:v) de CA (carbón activado) provocó 30.0-40.0% de enraizamiento.  El injerto de los brotes obtenidos in vitro en patrones previamente establecidos bajo condiciones de aislamiento fue también efectivo.  Se obtuvieron plantas completamente conformadas cuando se extrajeron embriones maduros y se cultivaron en medio MS y DF (Dixon y Fuller, 1976) sin reguladores del crecimiento.  La adición de CA (0.5%) garantizó un mejor crecimiento y un sistema radical bien conformado.  Se lograron establecer microinjertos in vitro, utilizando como patrones las plantas obtenidas por cultivo de embriones.  Se emplearon explantes nodales de plantas de vivero etioladas del cultivar ‘Duke-7’ para establecer la técnica de multiplicación in vitro.  La emisión de brotes fue posible en el medio DF con 2.0 mg·litro^-1 de BA y de GA₃, respectivamente, pero no hubo formación de brotes múltiples en ninguna de las combinaciones de reguladores empleadas.  Se logró el enraizamiento cuando al medio se incorporó 2.0 mg·litro^-1 de AIB y 1.0 mg·litro^-1 de GA₃, así como con 5.0 mg·litro^-1 de AIB y  1.0 mg·litro^-1 de GA₃, con porcentajes de éxito de 83.3 y 98.0%, respectivamente.  La aclimatación de las plantas fue del 40.0%, y el crecimiento fue más lento comparado con el de las provenientes de semillas en los viveros comerciales.

PALABRAS CLAVE: Aguacate, cultivo de tejidos, reguladores de crecimiento.

 

 

INTRODUCCIÓN

Dentro de los frutales tropicales, el aguacatero (Persea americana Mill.) presenta gran importancia en Cuba,  por el amplio consumo de sus frutos y por las posibilidades de comercialización. El desarrollo de programas de mejoramiento en el país, impone la necesidad de establecer metodologías para la multiplicación vegetativa, para el cultivo de embriones maduros e inmaduros, y para el microinjerto in vitro, aspectos que constituyen objetivos del presente trabajo.  Investigaciones en estas direcciones se están desarrollando en diferentes países a escala mundial (Skene y Barlass, 1983; Pliego Alfaro et al., 1986; Pliego y Murashige, 1987;Schall, 1987; Solorzano, 1989; González et al., 1991 a; 1991 b; Mohamed-Yasen, 1993; Biasi et al., 1994; Rodríguez et al., 1992; 1993; 1995; 1997;1998).

MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los experimentos se realizaron en el Departamento de Desarrollo y Extensión Agrícolas, del Instituto de Investigaciones de Cítricos y otros Frutales, en Alquízar, La Habana, Cuba.

El material vegetal estuvo constituido por frutos maduros e inmaduros de diferentes cultivares de aguacatero (Persea americana Mill.) procedentes de la colección, y por plantas jóvenes de semillas, e injertadas con los cultivares Suardía y Duke-7, que crecieron en invernaderos, bajo condiciones de humedad relativa y temperatura controladas.

A todos los medios de cultivo se le añadieron 30 g·litro^-1 de sacarosa (excepto en el experimento donde se siguió la técnica de microinjerto de González et al., 1977, donde se utilizó 75 g·litro^-1), y el pH se ajustó a 5.7 ± 0,1.  Cuando se empleó medio sólido se agregaron 7 g·litro^-1 de agar-agar.  En todos los casos la esterilización se realizó en autoclave a 121°C y a una presión de 1.2 kg·cm^-2 durante 15 minutos.

Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 27 ± 1°C y a un fotoperíodo de 16 horas luz, con lámparas de luz blanca fluorescente, a una intensidad lumínica de 80 E·m^-2·s^-1.

En todos los análisis de varianza que se detectaron diferencias significativas entre tratamientos, se realizó una prueba de comparación de medias para un nivel de significación del 5% (Duncan, 1960)

Cultivo in vitro de embriones

Se colectaron frutos pequeños (1.0-24.0 g) de diferentes cultivares de aguacatero: ‘Hass’, ‘Suardía’, ‘Catalina’, y ‘Jaruco N° 1’, se lavaron con detergente y agua corriente, y se sumergieron en etanol al 96% para ser flameados en la cámara de flujo laminar previo a la extracción de embriones.

Se extrajeron los embriones adjunto a los cotiledones y se cultivaron en el medio de Murashige y Skoog (1962) diluido al 50% (MS½), líquido, suplementado con 0.5 mg·litro^-1 de 6-bencil aminopurina (BA), y con 0.5 mg·litro^-1 de BA y 0.5 mg·litro^-1 de ácido giberélico (GA₃), respectivamente. Cuando comenzaron a separarse los cotiledones, se extrajeron, y la mitad que contenía el embrión se subcultivó en el mismo medio de cultivo, para facilitar la absorción de nutrientes.

Se evaluó el número de embriones contaminados, los muertos, los latentes y los que crecieron en cada caso.  Donde se detectó crecimiento se determinaron el número y la longitud de los brotes emitidos.

A los 45 días de cultivo, los brotes se subcultivaron en el medio sólido de Murashige y Skoog (1962) (MS) con 2.0 mg·litro^-1 de ácido indol-3-butírico (AIB).  Se consideró la adición o no de carbón activado al 0.5% (p:v).  A los 45 días de cultivo se evaluó el número de brotes enraizados.

Además, se escindieron 10 brotes y se injertaron in vivo sobre patrones que crecieron bajo condiciones de aislamiento. Las plantas injertadas se mantuvieron a un régimen de alta humedad relativa y una temperatura de 25 ± 2°C. Se determinó el porcentaje de prendimiento.

Se tomaron semillas de frutos maduros y se sometieron al mismo método de desinfección superficial descrito anteriormente.  Seguidamente se extrajeron los embriones con una porción pequeña de cotiledón y se cultivaron en los mismos medios de cultivo empleados para embriones inmaduros, pero en estado sólido.  Después de 45 días, los brotes emitidos se subcultivaron en un medio MS con 2.0 mg·litro^-1 de AIB y con la adición o no de  CA al 0.5% (p:v).

Se cultivaron embriones maduros en los medios MS y DF (Harty, 1985) sin reguladores del crecimiento y considerando la adición o no de carbón activado al 0.5% (p:v). A los 35 días de cultivo se evaluó el número de embriones que crecieron, y en cada tratamiento se determinó la altura de las plántulas (en mm), la longitud de la raíz principal (en mm), el diámetro a nivel del cuello (en mm), el número de hojas y el número de raíces secundarias.  Los datos obtenidos se procesaron directamente, exceptuando las dos últimas variables que se transformaron a x^½ y a (x + 0,5)^½, respectivamente, mediante un análisis de varianza simple, siguiendo un diseño de bloques al azar con 7 réplicas de cuatro embriones cada una.

Microinjertos in vitro

Se utilizaron como patrones plantas de ‘Duke-7’, etioladas o no, obtenidas a través de cultivo de embriones maduros.  Como fuente de ápices se emplearon yemas terminales de plantas obtenidas de la misma manera que los patrones, pero del cultivar Suardía.

Los microinjertos se realizaron según la metodología descrita por González et al. (1977) empleada para cítricos, que consiste en un corte en forma de ventana triangular en el extremo del patrón decapitado, donde se implantó el ápice. Las plantas microinjertadas se cultivaron en medio MS líquido con las vitaminas de White y 75 mg·litro^-1 de sacarosa.

Patrones de ‘Duke-7’ obtenidos por la misma vía, se microinjertaron utilizando la técnica sugerida por Pliego-Alfaro et al. (1986), con yemas axilares provenientes de plantas jóvenes injertadas del cultivar Suardía.  La misma consistió en el aislamiento de la yema practicando un corte en forma de cuña en el vástago previamente desinfectado, la cual se situó en una incisión vertical practicada en el extremo del patrón decapitado.  Se utilizó medio MS sólido con 1.0 mg·litro^-1 de BA.

En ambas metodologías se determinaron los porcentajes de prendimiento.

Multiplicación in vitro

Se empleó como material vegetal plantas procedentes de semillas e injertadas de ‘Duke’, las cuales, después de podadas se colocaron en una cámara oscura para inducir la emisión de brotes etiolados.  Posteriormente se asperjaron con fungicidas de contacto y sistémicos de forma alternada a intervalos semanales.  A partir de los 30-45 días se tomaron secciones de ramas y se practicó la siguiente desinfección superficial: Lavado  con  agua  continua  por dos horas;  agitación durante quince  minutos  en  hipoclorito de   sodio  (1.25%  de cloro activo) con tres gotas de tween 80 por cada 100 ml de solución; tres enjuagues con solución acuosa de ácido cítrico (250 mg·litro^-1) estéril.

Para el establecimiento in vitro se emplearon ápices caulinares (1.0 cm) y explantes nodales (0.6 cm) y se cultivaron en los medios MS_M (Schall, 1987) y DF (Dixon y Fuller, 1976) suplementados con 2.0 mg·litro^-1 de BA (6-bencil aminopurina) y con 2.0 mg·litro^-1 de GA₃ (ácido giberélico), respectivamente. A los 45 días de cultivo se determinaron el porcentaje de brotación y la longitud de los brotes (cm).  Los datos se evaluaron a través de análisis de varianza simple, previa transformación a arcsen(x)^1/2 en el primer caso y  a  x + 0.5 en el segundo.

Brotes de aproximadamente 1.0 cm  se subcultivaron en MS_M y DF suplementados con 2.0 y  con 5.0 mg·litro^-1 de BA.  Se evaluó además el efecto de la adición  de 40 mg·litro^-1 de L-arginina y L-glutamina.  Se determinaron el número de brotes por explante y su crecimiento  (cm), así como el grado de expansión del limbo foliar de forma cualitativa. Los datos del número de brotes por explante se transformaron a (x)^1/2 y se evaluaron a través de análisis de varianza simple.  Los brotes se clasificaron en dos categorías de acuerdo a su tamaño: (0.5-1.0 cm) y (1.1-2.0 cm) y se determinaron los porcentajes en cada caso.  Los datos se evaluaron mediante análisis de varianza simple previa transformación a arcsen(x)^1/2.

Para el enraizamiento in vitro  se empleó el medio basal DF suplementado con 2.0 mg·litro^-1 de AIB (ácido indol-3-butírico); 2.0 mg·litro^-1 de AIB + 1.0 mg·litro^-1 de GA₃; 5.0 mg·litro^-1 de AIB y 5.0 mg·litro^-1 de AIB + 1.0 mg·litro^-1 de GA₃.  En todos los casos se adicionó CA al 0.5% (p:v).  A los 60 días se determinó el porcentaje de brotes enraizados y los datos se procesaron mediante análisis de varianza simple, previa transformación a arcsen(x)^1/2.

Las plantas obtenidas se subcultivaron durante 15 días en medio líquido con las sales de DF reducidas al 50% sin reguladores del crecimiento y 15 g·litro^-1 de sacarosa, y se incorporó luz incandescente al sistema de iluminación  antes de la aclimatación.

RESULTADOS

Cultivo in vitro de embriones

En el Cuadro 1, se exponen los resultados obtenidos con embriones inmaduros cultivados en ambos medios de cultivo.  Se detectó que el porcentaje de contaminación fue relativamente alto, debido fundamentalmente a la presencia de bacterias en los frutos colectados.

Se observó que el porcentaje de embriones establecidos es bajo, si se toma en consideración el total cultivado in vitro; sin embargo, los que se mantuvieron latentes, y donde sólo se observó un engrosamiento de los cotiledones, son reducidos (Cuadro 1).  La respuesta fue superior en el medio que contenía GA₃, pero en ambos se detectó la emisión de 3 a 10 brotes por embrión, los cuales pueden llegar a tener entre 2.0 y 5.0 cm de altura, y con la presencia de gran número de hojas con la lámina foliar reducida.  En embriones maduros hubo respuesta similar en el 60.0% de los cultivos.

 

 

Se pudo constatar que los embriones provenientes de frutos con una masa menor de 10.0 g, o lo que es equivalente, de una longitud de 30.0 – 40.0 mm, prácticamente no responden a ninguno de los medios empleados.

El subcultivo a un medio sólido con 2.0 mg·litro^-1 de AIB y 0.5% de CA provocó el 33.8% de enraizamiento en los brotes provenientes de embriones inmaduros.  Cuando se emplearon brotes obtenidos a partir de embriones maduros se alcanzó el 40.15% de enraizamiento.

Se pudo comprobar además, que el injerto in vivo de los brotes sobre patrones que crecieron bajo condiciones de aislamiento fue exitoso en el 70.0 % de los casos.

 

 

El cultivo de embriones maduros en los medios MS y DF, sin la adición de reguladores del crecimiento y con el suplemento o no de CA (0.5%), demostró resultados alentadores.  En todos los casos se formaron plántulas en más del 80.0 % de los cultivos.

En el Cuadro 2 se muestran los resultados obtenidos producto de las mediciones de las cinco variables evaluadas.  En tres de ellas se detectaron diferencias significativas entre tratamientos: altura de los brotes, longitud de la raíz principal y el número de raíces secundarias.  Los mejores resultados se obtuvieron en el medio DF suplementado con CA.  También en el medio MS con CA se obtuvieron resultados alentadores, pero el desarrollo del sistema radical fue más pobre.

Microinjertos in vitro

De los microinjertos realizados por el método de González et al. (1977), prendieron el 20.0 % cuando se utilizaron patrones sin etiolar, y crecieron sólo el 11.4%.  La aclimatación de las plantas microinjertadas fue baja.  El empleo de patrones etiolados fue totalmente inefectivo.

Cuando se empleó la técnica sugerida por Pliego-Alfaro et al. (1986) el prendimiento de los microinjertos fue sólo del 5.0 %.  Se produjo oxidación de los tejidos tanto en las yemas como en el corte realizado al patrón.  Al igual que en el caso anterior, la adaptación de las plantas en la fase de aclimatación fue baja.

 

 

Multiplicación in vitro

Plantas procedentes de semillas:

La brotación durante la fase de establecimiento in vitro estuvo influenciada por el tipo de explante y de medio basal, así como por la combinación de reguladores del crecimiento (Cuadro 3).  Los mayores valores se alcanzaron en explantes nodales, los que generalmente difirieron significativamente del resto, y hubo mayor efectividad cuando se empleó medio DF con la adición de 2.0 mg·litro^-1 de BA y 2.0 mg·litro^-1 de GA₃, al considerar las dos variables evaluadas.  El crecimiento en los ápices caulinares fue a partir del desarrollo de yemas laterales y no por la elongación de la apical.

Durante la fase de multiplicación in vitro se obtuvieron mejores resultados en los medios que contenían 2.0 mg·litro^-1 de BA, lo cual se puso de manifiesto a través de un mayor crecimiento de los brotes (Cuadro 4).  La adición de 5.0 mg·litro^-1 del regulador tuvo un efecto negativo que provocó el deterioro y la muerte de algunos explantes.  En casi todos los tratamientos no se detectaron la formación de brotes múltiples, solamente cuando al medio DF se adicionó 2.0 mg·litro^-1 de BA se obtuvieron 2 brotes de forma eventual.  Cuando se incorporaron la L-arginina y la L-glutamina a razón de 40 mg·litro^-1 se vio favorecido el desarrollo de la lámina foliar.